|
|
Využití separačních metod pro studium vybraných léčiv a pesticidů ve vodách
Burešová, Jitka ; Hajšlová, Jana (oponent) ; Chýlková, Jaromíra (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Vávrová, Milada (vedoucí práce)
Dizertační práce je zaměřena na získání poznatků o průniku pesticidů a léčiv do vodního prostředí. Cílem bylo vyvynutí a ověření optimální metody vhodné pro dlouhodobé sledování výskytu vybraných pesticidů a léčiv v povrchových vodách. Z léčiv byla pro sledování vybrána velmi často užívaná analgetika ibuprofen a diklofenak a antiepileptikum karbamazepin. Dále bylo pro sledování vybráno celkem 41 pesticidů, pozornost byla zaměřena na skupinu močovinových pesticidů a skupinu fenoxykarboxylových kyselin, dále na vybrané pesticidy patřící do skupiny prioritních látek, na vybrané pesticidy určené jako normy environmentální kvality a vybrané pesticidy, jejichž roční spotřeba v České republice převyšuje 30 tun. Pro stanovení byla vybrána metoda kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS/MS). Vybrané analyty byly stanovovány ve dvou skupinách, 10 analytů při negativní ionizaci a 34 analytů při pozitivní ionizaci. Pro přečištění a zakoncentrování vzorků byla používána exprakce pevnou fází (SPE). Vypracovaná metodika byla ověřena validací a použita pro sledování výskytu vybraných látek ve vzorcích povrchových vod z oblasti povodí řeky Moravy. Vzorky byly odebírány jedenkrát měšíčně po dobu dvou let na řekách Moravě a Svratce. Po dobu jednoho roku byl sledován tok řeky Blaty a potoka Nivničky. Jednorázově byl také prozkoumán tok řeky Litavy, ze které byly odebrany v jeden den čtyři vzorky tak aby pokryly celý její tok. Výběr menších toků pro sledování proběhl na základě pravděpodobnosti výskytu pesticidů, vzhledem k jejich průtoku hojně zemědělsky obdělávanými oblastmi. Léčiva ibuprofen a diklofenak byla detekována ve všech odebraných vzorcích, karbamazepin v převážné většině. Mezi nejčastěji se vyskytující pesticidy patřily bentazon, diuron, isoproturon, karbendazim, MCPA, MCPP, propikonazol, tebukonazol a 2,4-D.
|
|
|
Využití separačních metod pro studium biologicky aktivních látek ve vodách
Vydrová, Lucie ; Friedl, Zdeněk (oponent) ; Opatřilová, Radka (oponent) ; Chýlková,, Jaromíra (oponent) ; Vávrová, Milada (vedoucí práce)
Léčiva patří mezi biologicky aktivní látky, které se odlišují různými funkčními skupinami, fyzikálně-chemickými a biologickými vlastnostmi. Tyto chemické látky, v současnosti zařazované mezi „nové“ kontaminanty, se kumulují v různých složkách životního prostředí. Do životního prostředí se dostávají v průběhu jejich průmyslové výroby, dále v důsledku používání v léčebných zařízeních nebo v domácnostech. Protože se jedná o látky biologicky aktivní, mohou v různých složkách životního prostředí negativně ovlivňovat zde probíhající procesy. Léčiva se vyznačují po chemické stránce vesměs odlišnou strukturou, a proto jsou často rozdělována nejen podle struktury, ale zejména podle jejich účinku na živé organismy. Na základě posouzení množství používaných léčiv v České republice lze konstatovat, že nejčastěji používanými léčivy jsou nesteroidní protizánětlivé léky patřící do skupiny analgetik. Důvodem jejich velkého rozšíření je především to, že téměř všechny si lze zajistit bez lékařského předpisu. Vybraná analgetika byla sledována nejen v odpadních vodách odebrané z velkokapacitní čistírny odpadních vod situované v Brně – Modřicích, ale také v povrchové vodě z povodí řeky Křetínky, kde byla odebírána ze dvou odběrových míst. Kontaminace povrchových vod léčivy typu analgetik byla hodnocena nejen v České Republice, ale také v povodí řeky Thurso ve Skotsku a na Taiwanu. Pro extrakci sledovaných reziduí z matrice byla ve všech případech použita extrakce pevnou fází (SPE). Jako analytická koncovka byla pro experimenty prováděné v České republice aplikována vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) s detekcí diodovým polem (DAD) nebo hmotnostní spektrometrie (MS). Pro experimenty hodnocené ve Skotsku a na Taiwanu byla také použita kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí. Metoda HPLC/MS umožňuje zjišťovat hodnocené analyty i ve velmi nízkých koncentracích (ng ? l-1). V rámci prováděných experimentů byla většinou identifikována a následně kvantifikována všechna sledovaná analgetika, a to jak v odpadních vodách, tak také z povodí řeky Křetínky v České republice. Totéž lze konstatovat také pro nálezy zjištěné v povrchových vodách v povodí řeky Thurso ve Skotsku a v povodí tří řek na Taiwanu a zjištěné koncentrace analgetik v povrchových vodách z různých světových lokalit byly porovnány.
|
|
|
Multidisciplinární charakterizace interakcí mezi estrogenními hormony a jejich receptory při kapacitaci spermií.
Bosáková, Tereza
Tato disertační práce byla zaměřena na multidisciplinární charakterizaci interakcí mezi hormony a jejich receptory při kapacitaci spermií, která je finálním krokem maturace spermií u savců a je k oplození vajíčka klíčová. Pro studium byly vybrány tři estrogenní hormony (17β- estradiol (E2), 17α-estradiol (αE2), 17α-ethynylestradiol (EE2)), které jsou součástí znečištění životního prostředí. Tyto hormony, jsou nazývané jako endokrinní disruptory, neboť mohou vyvolat u živočichů poruchy hormonálního systému, a tím negativně ovlivnit fyziologické procesy včetně reprodukce. Nově vyvinutou analytickou HPLC-MS/MS metodou byly sledovány koncentrační změny daných estrogenů (E2, αE2 a EE2) během časově závislé kapacitace myších, resp. potkaních, spermií in vitro. Pro jednotlivé estrogeny byly definovány závislosti koncentrace volného, na spermie nevázaného hormonu na čase kapacitace pro tři vsádkové koncentrace jednotlivých hormonů (200, 20 a 2 μg/L). Získané koncentrační hodnoty byly převedeny na hodnoty relativních koncentrací, které byly podrobeny kinetické analýze. Pro interakci jednotlivých hormonů se spermiemi byly navrženy kinetické modely, které byly popsány systémem diferenciálních rovnic s optimalizací rychlostních konstant a molárního poměru. Optimalizace probíhala na základě hledání minima...
|
|
|
Similarity search in Mass Spectra Databases
Novák, Jiří ; Skopal, Tomáš (vedoucí práce) ; Svozil, Daniel (oponent) ; Nahnsen, Sven (oponent)
Tandemová hmotnostní spektrometrie je známá metoda pro identifikaci proteinových a peptidových sekvencí ze vzorků biologického materiálu. Hmotnostní spektrometr generuje desetitisíce spekter, která musí být následně anotována peptidovými sekvencemi. Za tímto účelem lze využít podobnostní vyhledávání v databázích teoretických spekter generovaných z databází známých proteinových sekvencí. Vzhledem k tomu, že objem těchto databází každoročně narůstá téměř exponenciálním tempem, je zapotřebí hledat nové způsoby pro jejich indexování. V této práci se zaměřujeme na využití (ne)metrických přístupových metod jako databázových indexů pro rychlé a aproximativní podobnostní vyhledávání v databázích spekter. Navržená metoda identifikace peptidových sekvencí dosahuje více než 100-násobného zrychlení oproti sekvenčnímu průchodu celé databáze, přičemž je správně anotováno přes 90% spekter. V současnosti je metoda vhodná zejména pro malé směsi proteinů. Pro komplexní směsi proteinů využíváme indexovací metodu založenou na prekurzorovém hmotnostním filtru, která má při použití s modifikací parametrizované Hausdorffovy vzdálenosti vyšší rychlost i přesnost vyhledávání než běžně používané metody. Navržené metody jsou implementovány v aplikaci SimTandem, kterou lze použít pro dávkové zpracování ve frameworku TOPP...
|
|
|
Analýza změn sekretomu hepatocytárních buněk při zvýšené koncentraci homocysteinu pomocí dvojrozměrné elektroforézy
Chrudinová, Martina ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Homocystein je aminokyselina, která obsahuje ve své struktuře síru, a je odvozená od methioninu. Jedná se o nekódovanou aminokyselinu, která je součástí několika metabolických drah a vyskytuje se v krevní plazmě. Zvýšená koncentrace homocysteinu v krvi doprovází řadu onemocnění, jako jsou kardiovaskulární a neurodegenerativní choroby, cukrovka nebo osteoporóza. Proto v posledních dvou desetiletích dochází k velmi intenzivnímu zkoumání mechanizmů souvisejících s metabolizmem homocysteinu. V rámci této bakalářské práce byla provedena proteomická analýza sekretomu jaterních buněk, konkrétně byly porovnávány proteiny sekretované primárními lidskými hepatocyty vystavenými 2mM koncentraci homocysteinu s proteiny sekretovanými stejnými buňkami v prostředí bez přidaného homocysteinu. Analýza byla provedena pomocí dvojrozměrné elektroforézy. Buňky byly 48 hodin kultivovány v bezsérovém médiu (kontrolní skupina a skupina s 2mM homocysteinem) a proteiny sekretované do média byly vysráženy acetonitrilem. Byla provedena dvojrozměrná elektroforéza. Výsledné proteinové mapy byly vyhodnocovány pomocí počítačového programu PDQuest Advanced 8.0.1 2D Gel Analysis Software (Bio-Rad, USA). Jako rozdílně sekretované proteiny byly určeny ty, jejichž skvrny měly intenzitu větší než 500 ppm a u nichž byl rozdíl v intenzitě mezi...
|
|
|
Využití vysokoúčinných separačních metod pro analýzy biologicky aktivních látek
Adamusová, Hana ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Jelínek, Ivan (oponent) ; Tůma, Petr (oponent)
V rámci první části disertační práce byla vypracována nová analytická metoda HPLC-MS/MS pro sledování koncentračních změn 17β-estradiolu (βE2) během kapacitace myších spermií in vitro. Kapacitace byla prováděna se třemi počátečními koncentracemi βE2 (200, 20 a 2 μg/L). Pro všechny koncentrace byl pozorován obdobný trend závislosti koncentrace nevázaného βE2 na čase kapacitace. Koncentrace βE2 se snižovala, aby dosáhla svého minima a poté se opět zvyšovala. Pozice minima se lišila pro jednotlivé testované koncentrace βE2. Experimentálně získané výsledky byly podrobeny kinetické analýze. Křivky proložené experimentálně získanými body vykazovaly autokatalytický charakter. Pro shodu mezi křivkami, získanými proložením experimentálními body, a teoreticky vypočítanými křivkami je nutné předpokládat, že prvním krokem je adsorpce βE2 na povrch spermií řízená Langmuirovou izotermou. Kinetická studie byla použita i pro studium působení fluoridů a fluorohlinitých komplexů na kapacitaci myších spermií. Bylo zjištěno, že teoreticky získané křivky vykazují velmi dobrou shodu s experimentálně získanými body, tento fakt potvrzuje mechanismus kinetiky kapacitace myších spermií. Ve druhé části této disertační práce byly vyvinuty dvě analytické metody pro chirální separaci aclidinium bromidu (AB) a tapentadolu...
|
|
|
Multidisciplinární charakterizace interakcí mezi estrogenními hormony a jejich receptory při kapacitaci spermií.
Bosáková, Tereza ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Smrček, Stanislav (oponent) ; Postlerová, Pavla (oponent)
Tato disertační práce byla zaměřena na multidisciplinární charakterizaci interakcí mezi hormony a jejich receptory při kapacitaci spermií, která je finálním krokem maturace spermií u savců a je k oplození vajíčka klíčová. Pro studium byly vybrány tři estrogenní hormony (17β- estradiol (E2), 17α-estradiol (αE2), 17α-ethynylestradiol (EE2)), které jsou součástí znečištění životního prostředí. Tyto hormony, jsou nazývané jako endokrinní disruptory, neboť mohou vyvolat u živočichů poruchy hormonálního systému, a tím negativně ovlivnit fyziologické procesy včetně reprodukce. Nově vyvinutou analytickou HPLC-MS/MS metodou byly sledovány koncentrační změny daných estrogenů (E2, αE2 a EE2) během časově závislé kapacitace myších, resp. potkaních, spermií in vitro. Pro jednotlivé estrogeny byly definovány závislosti koncentrace volného, na spermie nevázaného hormonu na čase kapacitace pro tři vsádkové koncentrace jednotlivých hormonů (200, 20 a 2 μg/L). Získané koncentrační hodnoty byly převedeny na hodnoty relativních koncentrací, které byly podrobeny kinetické analýze. Pro interakci jednotlivých hormonů se spermiemi byly navrženy kinetické modely, které byly popsány systémem diferenciálních rovnic s optimalizací rychlostních konstant a molárního poměru. Optimalizace probíhala na základě hledání minima...
|
|
|
Využití HPLC a LC-MS/MS metod v diagnostice dědičných metabolických poruch
Bártl, Josef
V rámci této disertační práce byly vyvinuty a optimalizovány metody kapalinové chromatografie (HPLC) a tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS) a následně využity pro diagnostiku dědičných metabolických poruch. První tematický okruh popisuje zavedení komplexního laboratorního postupu pro diagnostiku pacientů s dědičnou xanthinurií využívající kvantifikaci klíčových biochemických markerů a stanovení aktivity enzymu v plazmě. Pro tyto účely byla zavedena HPLC metoda s detekcí diodového pole pro kvantifikaci hypoxanthinu, xanthinu, allopurinolu a oxypurinolu v moči a plazmě a metoda pro stanovení pterinu a isoxanthopterinu v plazmě využívající HPLC separaci a detekci látek fluorimetrickým detektorem. Tyto metody byly úspěšně aplikovány v klinické praxi při diagnostice dvou pacientů s xanthinurií I. typu. Druhý tematický okruh je věnován vývoji a klinické aplikaci LC-MS/MS metody pro kvantitativní stanovení celkového homocysteinu (tHcy), methioninu (Met) a cystathioninu (Cysta) v suché krevní kapce a plazmě. Bylo prokázáno, že tato metoda dokáže detekovat pacienty s homocystinurií a zároveň rozlišit na základě koncentračních poměrů jednotlivých analytů, zda je porucha v transsulfurační či remethylační části metabolismu homocysteinu. Díky jednoduchému odběru a transportu vzorku suché krevní kapky...
|
|
|
Tandemová hmotnostní spektrometrie sfingolipidů s aplikací pro metabolické studie a diagnostiku sfingolipidos
Kuchař, Ladislav
V posledních letech se hmotnostní spektrometrie (MS) stala dominantní technologií používanou při lipidomické analýze a silně ovlivnila výzkum a diagnostiku onemocnění lipidního metabolismu jako např. lysosomální střádavá onemocnění (LSD) charakterisovaná poruchami funkcí lysosomů. Soubor poruch lysosomální degradace sfingolipidů (SFL) přísluší ke skupině sfingolipidos. Tento stav má vážné až fatální klinické důsledky. Prvotním cílem práce bylo zavedení kvantitativní a kvalitativní analýzy SFL pro výzkum a diagnostiku LSD. Na jejím počátku bylo třeba připravit semisynthesou lipidní hmotnostně značené standardy pomocí imobilizované sfingolipid ceramid N-deacylasy. Zavedené metody kvantitativní analysy byly posléze použity k průkazu zvýšené exkrece močových SFL u LSD s charakteristickým střádáním v ledvinách. Vyhodnocení SFL vylučovaných močí prokázalo svůj význam při diferenciální diagnostice deficitu prosaposinu a saposinu B kdy rutinní enzymologie selhává. MS navíc umožňuje sledování jednotlivých molekulárních druhů SFL (isoforem), jenž vedlo ke zjištění, že u některých LSD se jejich profil v moči mění. To následně vedlo k vývoji nové screeningové metody v suchém vzorku moče založeném na vyhodnocování profilu isoforem. Další aplikací MS byla analýza pitevních vzorků tkání nebo buněk u nevyjasněných...
|
|
|
Pathology and physiology of de novo purine synthesis.
Krijt, Matyáš ; Zikánová, Marie (vedoucí práce) ; Šebesta, Ivan (oponent) ; Čajka, Tomáš (oponent)
Puriny jsou organické sloučeniny s rozmanitými funkcemi, které se nacházejí ve všech živých organismech ve složitých molekulách, jako jsou nukleotidy, nukleosidy nebo jako purinové báze. Jejich přirozená rovnováha v organismu je udržována syntézou, recyklací a degradací. Přebytek purinů se vylučuje močí jako kyselina močová. Purinové nukleotidy mohou být recyklovány záchrannými cestami, které katalyzují reakci purinové báze s fosforibosylpyrofosfátem. Zcela nová ústřední molekula purinového metabolismu, inosinmonofosfát, může být syntetizována z prekurzorů při de novo purinové syntéze (DNPS), která je aktivována v případech zvýšené potřeby purinů jako je např. vývoj organismu. DNPS zahrnuje deset kroků katalyzovaných šesti enzymy, které formují multienzymový komplex purinosom umožňující tok substrátů skrz tuto dráhu. Dosud byly popsány tři poruchy DNPS: deficit ADSL, AICA-ribosidurie a deficit PAICS. Všechny tři poruchy jsou způsobeny genetickými mutacemi vedoucími ke špatné funkci příslušného enzymu, které se dále projevují nedostatečnou aktivitou daného kroku DNPS. Biochemicky to znamená akumulaci substrátu poškozeného enzymu, biologicky narušení formování purinosomu a klinicky nespecifická neurologická postižení, což přispívá k problematické diagnostice poruch DNPS. Předpokládali jsme, že...
|
host ::
RSS.